Cromatografía de intercambio iónico como método simple y escalable para aislar pequeñas vesículas extracelulares biológicamente activas de medios condicionados.
(Ion exchange chromatography as a simple and scalable method to isolate biologically active small extracellular vesicles from conditioned media)
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Autores: Ricardo Malvicini, Diego Santa-Cruz, Anna Maria Tolomeo, Maurizio Muraca, Gustavo Yannarelli, Natalia Pacienza
Resumen:En los últimos años, las vesículas extracelulares (VE) se han vuelto de gran interés debido a su potencial como biomarcadores, sistemas de administración de fármacos y, en particular, agentes terapéuticos. Sin embargo, no hay consenso sobre cuál es la mejor manera de aislar estos VEs. La elección del método de aislamiento depende del material de partida (es decir, medios de cultivo condicionados, orina, suero, etc.) y sus aplicaciones posteriores. Aunque existen numerosos métodos para aislar vesículas extracelulares, pocos son compatibles con aplicaciones clínicas porque no son escalables. En el presente trabajo, configuramos un protocolo para aislar vesículas extracelulares de medios condicionados mediante cromatografía de intercambio iónico, un método simple, rápido y escalable, adecuado para la producción clínica. Realizamos el aislamiento utilizando una resina de intercambio aniónico (Q sefarosa) y eluimos las VEs utilizando NaCl 500 mM. Caracterizamos el perfil de elución midiendo la concentración de proteínas y lípidos, y CD63 mediante ELISA. Además, inmunofenotipamos todas las fracciones eluidas, evaluamos la presencia de TSG101, calnexina y citocromo C mediante Western Blot, analizamos el tamaño y la distribución de las nanopartículas mediante tRPS y la morfología mediante TEM. Finalmente, evaluamos la actividad inmunomoduladora in vitro. Descubrimos que la mayoría de las vesículas extracelulares se eluyen y concentran en una fracción de pico único, con un tamaño medio de partícula de <150 nm y expresión de los marcadores CD9, CD63, CD81 y TSG101. Además, las VEs de la fracción 4 ejercieron una actividad antiinflamatoria en los macrófagos estimulados por LPS. En resumen, configuramos un método cromatográfico, escalable y clínicamente compatible para aislar y concentrar vesículas extracelulares pequeñas a partir de medios condicionados, que preserva la actividad biológica de las vesículas extracelulares.
Disponible en: Plos One
